http://bio.ccxxba.com/index.php zh-cn http://bio.ccxxba.com/read.php/25.htm 飞翔的猪 <> Mon, 12 May 2008 12:08:40 +0000 http://bio.ccxxba.com/read.php/25.htm    技术方法是科学进步的驱动力，人们认为它们也应该受到重视。

   经评选，2007年最备受瞩目的技术方法就是——新一代测序技术（next-generation sequencing）。虽然它并不是科学家在2007年发明的新技术，但这种测序技术在2007年众多领域中起着十分重要的作用，此外，它还对相关研究领域产生了异常深远的影响。
   下文对2007年年度技术方法作出了详细的描述。

2007年：见证新一代基因测序技术的迅猛发展

   2007年，新一代测序技术因其在众多领域中的成功应用而得到广泛承认。

  在北卡罗来纳州立大学(North Carolina State University)毒理学大楼里，小型基因组实验室主任Nigel Deighton和其他研究人员一道，依靠来自罗氏诊断公司（Roche Diagnostics）的仅能维持三个月研究的贷款，开发研制出实验室第一台新一代测序仪——454 GS FLX（见文后注释1）。他们花了几天时间，处理一个同事保存的细菌DNA，使其成为雾化状态，接着进行PCR扩增。随后他们将与磁珠连接的PCR产物点样在平板上（平板上有肉眼看不见的小孔），再将平板放入仪器，关上吊桥一样的舱门，仪器便开始自动运行，进行序列测定了，而不再需要人工操作，于是他们便决定一起出去喝上一杯。


   第二天，Deighton浏览了该仪器生成的关于被测细菌基因组的最新测序图。在首次试运行中，GS FLX仪对待测基因组测序的覆盖率达到原有仪器的6倍以上，平均阅读长度（read length）大约为250个碱基，“这个成绩对于第一次运行来说，算是不错的了。” Deighton说道。

  在过去几年里，新一代测序技术平台在那些大型测序实验室中得到快速发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。而在2007年，即使是在更小规模的实验室，例如Deighton的实验室，也得以更好的运用这种测序平台。George Church如是说，他在哈佛医学院（Harvard Medical School）研制出了相关的测序技术。        

  2005年推出的454 Life Sciences仪器，是进入市场的首个测序平台。该公司于2007年被罗氏诊断公司收购。而Solexa,Inc.在2006年6月也推出了自己的新一代测序仪器，该仪器将“合成测序”化学法（sequencing-by-synthesis chemistry）与“DNA簇技术”(DNA cluster technology)相结合，随后该公司被Illumina收购。2007年10月，Applied Biosystems宣布其研制出了ABI SOLiD系统，成为投入市场的唯一采用“基于序列连接的化学法”（ligation-based）的测序平台，在去年的全球基因组测序会议上，Church就曾指出上述测序平台在多方面得以应用。Broad研究院基因组测序及分析小组的副组长Chad Nusbaum说，研究人员们目前越来越多地将测序技术作为一种多功能手段去解决各种疑难问题。

   2007年，研究人员用新旧两代测序平台对人类基因组进行了测序。Baylor医学院（Baylor College of Medicine）和454 Life Sciences公司的研究人员，用两个月时间，花费一百万美元，对James Watson的基因组进行了测序。除此之外，还完成了其他两个个体基因组的测序，一个是Craig Venter，对Venter基因组的测序，就是以其建立的研究为基础而进行；另一个测序对象是一位中国人，测序工作在北京基因组研究所进行。J. Craig Venter研究所对Venter的DNA的测序采用的是Sanger法，耗时数年，共花费七千万美元左右。目前，该研究所致力于对更多个体的全基因组进行测序，测序工作将以新一代测序技术为平台，同时以Sanger法所得到的参考序列为基础，J. Craig Venter研究所的联合技术中心（J. Craig Venter Institute's Joint Technology Center）科学主任Yu-Hui Rogers这样对我们说。

   耶鲁大学（Yale University）研究人员与454 Life Sciences公司研究人员合作，将454测序技术与一种称为“paired-end mapping”的技术（见文后扩展阅读）相结合，检测人类基因组内的基因结构变异，研究结果发表于2007年10月的 《科学》杂志上。“该技术使我们有了新的发现。”该研究的第一作者Michael Snyder说，他所指的是基因序列中的某些基因转位与断裂点，如果采用比较基因组杂交及fosmid法，这些位点是无法检测出来的。Illumina DNA测序部门总经理John West和Applied Biosystem's SOLiD测序系统研发人员之一Kevin McKernan都表示，他们的公司都采用了“paired-end mapping”技术法对不同大小的基因结构变异进行研究。

  新一代测序技术对于较短的遗传序列，如与组蛋白结合的DNA片断、转录因子等的测定来说，亦是一大福音。来自美国国家心肺血液研究所（US National Heart, Lung and Blood Institute）的Keji Zhao所带领的研究小组，采用了染色质免疫沉淀分析（ChIP）技术对组蛋白修饰进行分析研究，研究结果发表于2007年的《细胞》杂志上。在其研究中，正是利用了Solexa平台较短的阅读长度这一特点，该研究也是最早一批运用Solexa技术的项目。

  Zhao说，以前我们运用传统的ChIP与基因表达系列分析（SAGE）技术相结合的方法进行此类研究，其中SAGE采用Sanger法对串联DNA标签进行测序。每完成一个组胺酸修饰的序列测序，需要花费将近10万美元；而如今采用Solexa仪器进行测序，每一个标签测序只需要2,000美元，大大降低了费用，节省下来的经费可用于对更多标签的测定。“没有这新一代的测序平台，我们不可能进行目前规模的任何研究。”Zhao说。另一位科学家Elaine Mardis说，新的测序平台对于Zhao的研究领域来讲是非常理想的，因为该技术可以直接对基因片段进行测序及鉴定，无需再用杂交法对序列进行鉴定。

  Mardis接着说道，环境基因组学（metagenomics，见注释2）这一新兴研究领域也从新一代测序技术的发展中获益。为揭示人体健康疾病状态与人体微生物群系的关系，美国国立卫生研究院（NIH）于2007年12月19日宣布正式启动的一项新的基因工程——人体微生物群系项目（HMP）就是一个例子。2007年9月，来自哥伦比亚大学，以W. Ian Lipkin为首的研究小组与454 Life Sciences联合在《科学》杂志上发表了一篇研究报告。报告中指出，他们在实验中鉴定出了一种与数十亿蜜蜂死亡有关的病毒。“环境基因组学的研究在传统测序时代是非常昂贵且繁琐的，” Mardis说：“现在，随着新一代测序平台的出现，这些实验变得简单易行了，而且也更容易从中获得新的息。”

  Church预言说，在2008年，人们将能够借助新的技术平台，更加透彻地认识基因序列与功能之间的关系。事实上，到目前为止，遗传序列与功能之间的关系的研究在2007年已经取得了很大的进步，速度由之前的一年分析一个序列显著提高到2007年的一年能分析研究60个序列。“那是个相当了不起的进步，但是对于绝大部分序列，并没有继续研究以找到形成相应功能的等位基因或等位片段。” Church说。想要了解序列与功能之间的确切关系，需要更多个体的基因组序列及相关表型数据。来自美国能源部联合基因组研究所（US Department of Energy's Joint Genome Institute）的遗传学家Len Pennacchio说：“从这一点上看，所测得的Watson的DNA还只是相当于一份组成基因组各项“零部件”的清单，尚不能够告诉我们基因组的各个因子是如何协调工作，使我们成为独一无二的个体的。”

  “早在2004年美国国立卫生研究院就提出研究目标——1000美元的成本进行人类基因组测序。尽管新一代测序技术还不能达到这个目标，但相关的研究人员正在向这个目标迈进。”Richard Mayers是斯坦福人类基因组中心主任，他这样告诉我们。

  目前看来，所要进行的下一步应该是建立起更为先进的计算机算法，以用于基因组测序过程中的拼接和比较。基因组测序中成千上万的序列片段需要研究人员深入研究以便鉴别出冗余序列，从而保证阅读框的正确。“这是个棘手的问题，但是我们已经开始将新一代技术应用于此。” Richard说。

  同时，Deighton还将把454 Life Sciences技术应用于北卡罗来纳州立大学目前的研究中。他们已经将细菌基因组进行了拼接，并且希望能够达到20倍的基因组覆盖率，这样就可以填补基因片段间的空隙。大约15名研究人员已经签订协议，将使用该测序仪器对各种生物物种进行测序。到3个月的贷款期期满之际，Deighton会进行经费分析，让同事们认识到，尽管该仪器售价高达50万美元，但其带来的低成本测序效益却是无法想象的。
原文检索：http://www.nature.com/nmeth/journal/v5/n1/full/nmeth1154.html

编者注：
1. GS FLX  罗氏诊断公司和454公司不断加大创新投入，又于2007年推出了通量更大，读长更长，准确性更高的第二代基因组测序系统——Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。GS FLX是世界上第一个可以提供超高通量基因组和长片段DNA测序的商业化系统设备，只需要一步简单的全基因组样品制备过程，就可以在7.5小时内获得超过1亿个碱基信息。


2. 环境基因组（metagenomics）  是指同时被研究的整个微生物群落的DNA。从历史观点上来看，微生物学主要集中于研究能够在实验室培养并在显微镜下检测的单个种类。但大多数微生物的复杂群落无法在实验室里培养，环境基因组学研究将使研究人员能够研究整个微生物群落，进而改变现代微生物学。这些被研究的微生物大多数是此前未知，且不能在实验里培养的物种。研究目的在于弄清微生物间的相互作用如何平衡大气组成、对抗疾病及支持植物生长。环境基因组研究是从生活于一个特定环境样本中的所有微生物中提取出DNA。提取出的遗传物质由上百万个DNA随机碎片组成。新的DNA序列测定技术和功能更强大的计算机，能够帮助研究人员让这些环境基因组图谱变得有意义。


扩展阅读：http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/1149504v1

原文检索：Nature Methods - 5, 11 - 14 (2008) doi:10.1038/nmeth1154

（生命奥秘：筱玥 编译）
Tags - 测序 ]]> http://bio.ccxxba.com/read.php/24.htm 飞翔的猪 <> Mon, 28 Apr 2008 00:27:12 +0000 http://bio.ccxxba.com/read.php/24.htm
一般公司测序说没有信号，其实并不是真的没有信号，是因为信号太多，很杂，无法阅读结果。

建议对测序样品进行克隆化，也就是划板子----挑单克隆----摇菌----再划板子，然后挑单克隆送测序。

1. 送菌液再测一次，反正测不出来又不要钱。

2. 尝试载体上的其它引物，反正商业化的质粒引物也不要钱。

3. 换家公司了，反正现在测序的公司一大把，价格也差不多。
Tags - 测序 ]]> http://bio.ccxxba.com/read.php/23.htm 飞翔的猪 <> Sun, 27 Apr 2008 02:12:23 +0000 http://bio.ccxxba.com/read.php/23.htm 出现非特异性扩增带

　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

　　其对策有：①必要时重新设计引 物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

　　出现片状拖带或涂抹带

　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

　　对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。
Tags - pcr ]]> http://bio.ccxxba.com/read.php/22.htm 飞翔的猪 <> Sat, 26 Apr 2008 14:44:51 +0000 http://bio.ccxxba.com/read.php/22.htm
       两种不同的质粒不能同时并存于同一宿主的细胞之内。互不相容的质粒群体可以被认为属于同样不相容的类别。对于大肠杆菌来说，已知有25个以上的不相容群体。

       同种的或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地保持在一个细胞内的现象，称为质粒的不相容性(plasmid incompatibility)，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。质粒的不相容性是质粒分类的重要标志。例如colEI派生质粒，它们之间是互不相容的，也就是说，这些亲缘关系较近的不同质粒，当两种进入同一细胞后，必定有一种在细胞的增殖过程中，被逐渐排斥(稀释)掉。称这些质粒间是不相容的。

       彼此不相容的质粒属于同一个不亲和群Gneompatiblity group)。而彼此能够共存的亲和质粒，则属于不同的不亲和群。大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。它们之间是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。

       如果使带有同种的或亲缘关系相近质粒的细菌彼此杂交，质粒DNA的传递可受抑制，但这种称为表面排斥（surface exclusion），以便与不相容性相区别。不相容现象的机制尚未详细阐明，可能是在质粒DNA复制的某个阶段起相互排斥的作用。这种现象是质粒分类的主要指标。此外，整合到寄主染色体中的质粒和自主性质粒之间也具有不相容性，例如在大肠杆菌的Hfr菌株细胞中，自主性质粒F因子就不能稳定地保持。

       有人曾用E. coli作过一个关于“质粒不相容性与拷贝数的关系”的实验。从实验我们知道质粒不相容的现象与质粒拷贝数及分离调控有关。一个相容群(Compatibilitygroup) 定义为一组在同种细菌细胞内不能共存的质粒,它们不相容的原因是它们在一些对质粒存在很重要的过程中不能彼此区分,而DNA 的复制和分离就是这种过程。质粒不相容性的负控制(Negative control) 模型符合这样的观点，即拷贝数控制是通过合成衡量原点浓度的抑制物完成的(这与调控细菌染色体复制的滴定模型相同)。

       我们可用同一相容群中另一种质粒的形式引入新原点模拟原有质粒的复制，这时存在两个原点，所以进一步的复制被抑制，直到两个质粒被分配到不同的细胞中，形成正确的复制前拷贝数。

       如果负责将产物分配到子细胞中的系统不能识别两个质粒则会出现相似的效应。例如，如果两个质粒有相同的顺式作用分离位点，它们之间的竞争就会保证将它们分离到不同的细胞中，在相同的品系中不能存活。从它们的目的来说质粒是自私的。进入细菌后，驻留的质粒阻止其它相同的质粒进入。质粒不相容性(Incompatibility) 是建立这些区域性权利的主要手段。一个相容群中一个成员的存在不能直接影响属于另一群的质粒存活。给定的相容群(带有单拷贝质粒)中只有一个复制子能留在细菌中，但不与其它相容群中的复制子相互作用(尽管在有限的条件下，它们能竞争lebensraum)。

       有人做过实验，如果两个质粒带有不同的抗性筛选标记，即使他们属于同一不相容群，如果持续的用抗性压力的情况下，两个质粒仍然可以在同一个细菌里面。当然在没有抗性压力的情况下，其中一个质粒很快就会丢失。
Tags - 质粒 ]]> http://bio.ccxxba.com/read.php/21.htm 飞翔的猪 <> Mon, 07 Apr 2008 01:35:54 +0000 http://bio.ccxxba.com/read.php/21.htm
R250(Coomassie brilliant blue R250)，C45H44O7H3S2Na，,MW=824，λmax=560―590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍.尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色，但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。

G250，又名Xylene brilliant cyaninG。比考马斯亮蓝R250多二个甲基，MW=854，λmax=590―610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍，优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色，所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。

G250中的G就是Green，偏绿，R250中的R代表Red，偏红，在进行小分子量蛋白的Tricine电泳是常用G250染色，至于加热，染和脱色都可以加热，但都是在急需知道结果的情况下采用，加热后染的背景色很重脱色时间就长而且很难将背景色脱干净，脱色液经常加热会导致固定剂的会发，很快脱色剂就没用了，脱色效果很差，而且加热挥发出来的甲醛对呼吸道有刺激作用因此尽量不要加热！

Coomassie G (green)-250 is greenish, stains bright blue, is less soluble and used in colloidal form (stain enters a protein better than the acrylamide, so background is minimized). Coomassie R (red)-250 dye is reddish, stains dark blue and is more soluble, usually resulting in high background. ]]> http://bio.ccxxba.com/read.php/20.htm 飞翔的猪 <> Wed, 02 Apr 2008 04:22:55 +0000 http://bio.ccxxba.com/read.php/20.htm
        甘油的保菌浓度一般在10％～30％之间，经常用25％的浓度来保存细菌。可以先把甘油配成百分之五十的浓度，然后高压，4度保存，随用随取，很方便，保存菌种时菌种和甘油按1：1的比例加入，甘油的终浓度是百分之二十五，不过要在超净台中操作。

        也可以把甘油灭菌后趁热分装在EP管中，然后-20 ℃保存，这样每次保存菌种的时候用几个拿几个，方便的很，又不会污染。
Tags - 菌种 ]]> http://bio.ccxxba.com/read.php/19.htm 飞翔的猪 <> Tue, 01 Apr 2008 13:25:38 +0000 http://bio.ccxxba.com/read.php/19.htm
Dear ....,

I am working on ......(工作背景). And one of my projects focuses on........(工作内容)Isolating ROG cDNA seems to be a problem hard to get over for us（为什么要要）. One of my graduates has been working on it for a couple of months, but no progress（一定以导师和教授口气写，学生写人家可能不愿意给）. We are happy to find that your laboratory was the major source of the ROG cDNA in many publications. Therefore, I am writing to explore the possibility of getting ROG cDNA from your laboratory. If you were kindly offering us the DNA(pCI-ROG), it would be very helpful for us. Of course, the DNA will never be used for commercial purpose.We will acknowledge the DNA resource and cite your papers in all our publications based on the DNA. We are also willing to put you into the author list that’s necessary. Sure, We would like to sign any contract for the DNA transfer.

One of my graduates is waiting for the DNA to set up his experiment, so your early response will be greatly appreciated.

Sincerely yours,

Tags - 质粒 , 菌种 ]]> http://bio.ccxxba.com/read.php/18.htm 飞翔的猪 <> Tue, 01 Apr 2008 13:08:39 +0000 http://bio.ccxxba.com/read.php/18.htm
        佐剂的作用原理主要包括三个方面，一是激活先天性免疫应答反应，如弗氏佐剂、免疫刺激复合物和CpG佐剂等。二是提高抗原对免疫系统的提呈和刺激作用，如脂质体类佐剂和免疫刺激复合物（ISCOM）。三是延长抗原（免疫原）在机体内的存在时间和保持对免疫系统的持续激活作用。很多佐剂中的矿物油成分主要是起到缓释作用。除了弗氏佐剂兼具这三种特性以外，大多数佐剂在功能上都存在一定的缺陷。根据来源不同，佐剂分为化学合成类佐剂和生物成分类佐剂。很多病原生物的组成成分本身就是天然的佐剂，如弗氏完全佐剂中的结核杆菌，乙肝病毒表面膜蛋白及细菌的LPS和CpG序列等。传统的佐剂多与抗原混合成乳胶（Emulsion）的形式注射使用。乳胶有“油包水”和“水包油” 两种形式。前者有利于延长抗原在体内的存在时间和提高抗原的免疫原性，但对局部组织具有很强的刺激反应。后者有利于抗原的快速吸收，副作用小，但免疫反应可能弱且持续的时间短。

        对佐剂的研究是疫苗研究过程中的重要组成部分。目前除了弗氏佐剂以外还没有任何一种佐剂能够对体液和细胞免疫系统同时发挥很有效的免疫激活作用。但弗氏佐剂能够引起注射部位组织的损伤和长时间的痛苦，因而只能用于对抗原的初期免疫应答研究及免疫血清或抗体的制备，不适合作为疫苗的组成成分使用。此外，在疫苗制备过程中选择哪一种佐剂还主要取决于所要获得的保护性免疫应答反应。有些佐剂以激发体液免疫应答反应为主，也有些佐剂则对细胞免疫应答反应具有很强的激活作用。

        1 铝盐佐剂
        铝盐（氢氧化铝和磷酸铝）佐剂是第一个被批准可用于人的佐剂。其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将蛋白质和氢氧化铝或磷酸铝混合注射，能够使抗原保存在注射部位，即“库存效应”，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。氢氧化铝或磷酸铝对促进抗原的吸收具有重要作用，但铝盐佐剂的作用机理目前尚不完全清楚。一般认为铝胶体对蛋白质分子具有很好的吸附作用。

        大量的临床免疫试验认为氢氧化铝胶体佐剂对TH2介导的体液免疫反应具有很强的激发作用，而对TH1介导的细胞免疫反应的作用较弱。此外，该种佐剂不适合作为肽抗原的佐剂。同其它佐剂一样，铝盐佐剂并不适合所有的抗原，与有些抗原混合注射后会引起局部炎症反应，有时还会形成肉芽肿。任何一种佐剂或疫苗的安全性都是I期临床实验的主要检测内容[1][2]。

        2  弗氏佐剂和油乳液
        弗氏佐剂是含油佐剂的一种，其最大的特点是具有较强的免疫增强效应，是应用最为广泛的实验用佐剂。弗氏佐剂包括弗氏完全佐剂（Freund’s complete adjuvant, FCA）和弗氏不完全佐剂 (Freun’s incomplated adjuvant, FIA)。FCA除了含有矿物油等成分外，还含有灭活结核杆菌,对体液和细胞免疫系统具有很强的激活作用。FCA只用于初始免疫（Priming），在以后的加强免疫（Boost）中只用FIA。佐剂与抗原的体积一般各占50％。最终所形成的抗原佐剂混合物是典型的“油包水”乳胶混合体。FCA能够刺激机体产生很强的体液免疫和细胞免疫应答，但也具有很强的副作用，特别是皮下注射时在注射部位引起很强烈的炎症和溃疡。由于注射部位强烈的副反应，该佐剂只用于实验目的的免疫研究，不适合用于制备疫苗。

        3  免疫刺激复合物（ISCOM）
        ISCOM(Immunostimulating complex)即免疫刺激复合物。它是由瑞典的Iscote公司研发的一类以脂质（lipid）、皂素（saponin）为主的复合型佐剂。在ISCOM基质中，皂素分子（Quil A）结合于固醇类和磷脂酰胆碱，可形成稳定的网状结构，其直径在30-40nm间，能够与抗原的疏水部分结合，从而将其亲水面暴露于免疫细胞。其优点是能够快速、有效地将抗原提承给免疫系统。可以在免疫后迅速激活机体的细胞免疫应答和体液免疫应答的效果。

        将含有ISCOM的疫苗注射接种后，T细胞应答首先在引流淋巴结中检测到，接种后50天，在骨髓中也有大量抗体产生细胞。由于抗原提呈细胞的内体小泡和胞质溶胶的双重作用，含ISCOM的疫苗可以通过MHC-I和MHC-II两种途径将抗原提呈给免疫系统，同时激活CD4+和CD8+淋巴细胞[3]。含ISCOM的疫苗的另一个优点是可以经口服或是鼻腔接种获得免疫，且能达到在局部和全身黏膜表面诱导有效和特异的黏膜应答[4]。小鼠鼻腔接种流感ISCOM疫苗后，可诱导坚强的黏膜抗体和CTL应答反应并可抵抗攻击感染。口服ISCOM疫苗除了可以引发MHC-I介导的CTL活性外，还有全身性免疫应答，包括特异抗体、分泌型IgA抗体、CD8+T细胞应答等。而且，研究显示重复低剂量口服ISCOM疫苗不会引起免疫耐受。

        然而，ISCOM在使用上也存在一些限制性因素。它并不是一种可以和任何抗原都能形成复合体的佐剂。只有那些含疏水基团很多的抗原或免疫原才能与IS- COM形成复合体，含亲水基团多的抗原（免疫原）不适合与ISCOM佐剂混合制备疫苗。

        4 脂质体（Liposome）和类病毒颗粒（Virosome）
        脂质体是一类以提高抗原输送和呈递为主要作用的佐剂。脂质体由磷脂和固醇类组成的含双层脂质分子的脂质球。其表面为疏水性结构，而内部为亲水性结构。其主要优点是脂质体膜对细胞膜具有很好的亲和性，容易将包被在脂质体上或内部的抗原（或编码抗原的DNA）成分输入到细胞内。目前可以根据要求制备直径不同的脂质球。也可以根据抗原分子的理化特性将抗原分子包被在脂质体的不同部位。如将含疏水性氨基酸较多的抗原插入脂双层中，而将含亲水性基团较多的抗原包裹在脂质球的中间区。脂质体疫苗可经粘膜免疫。由于脂质体膜与细胞膜的亲和性，非常有利于将包被的抗原提出给抗原处理细胞（Antigen proce- ssing cells, APC）并使抗原被溶酶体所降解进而通过MHC-I 和II 途径提呈给免疫系统，同时激发细胞和体液免疫应答反应。脂质体在制备过程中要求一定的技术性，其费用也较其它免疫佐剂高，目前对脂质体的应用研究还主要集中在医学研究方面，在兽医疫苗研究上的应用前景还具有一定的不确定因素。

        类病毒颗粒是在脂质体的基础上发展起来的一种抗原输送技术。将流感病毒的血凝素（HA）和神经氨酸酶的部分氨基酸序列定向地插入双层脂质球的膜中，使这两种分子中能与宿主免疫细胞表面的唾液酸相结合的基团暴露在表面，将抗原或编码抗原的DNA/RNA包裹在内部。由于这种脂质球对细胞的主动亲和作用（由HA和神经氨酸酶介导），在形式上近似于病毒与宿主细胞的作用过程，因而被称作类病毒颗粒。其优点是有利于抗原或药物分子的定向传输。利用该技术制备的流感疫苗已经在临床上发挥很好的免疫保护效果。

        5  CpG 佐剂
        高等生物在进化过程中逐渐形成对入侵的微生物（包括病毒、细菌、真菌和寄生虫）的天然识别功能。主要是位于免疫细胞（各种淋巴细胞、吞噬细胞、树突细胞）膜上的结构识别受体（Pattern recognition receptors 即 Toll-like receptors）能够特异性地识别侵入体内地病原生物。能够被高等生物先天性免疫系统识别地病原成分很多，其中细菌和病毒的DNA（也包括RNA）是被免疫系统识别的主要成分之一。在多细胞生物，其DNA序列中的CpG基团多被甲基化，而微生物的核酸序列中含CpG基团较多，且多数为非甲基化。在真核细胞（尤其是具有免疫功能的细胞）表面有一种识别非甲基化CpG基团的受体（Toll-like receptor 9）。当该受体与非甲基化CpG结合后，就会激发天然的非特异性免疫应答反应(如细胞内干扰素、细胞坏死因子等合成增加，抗原处理细胞的功能增强等)。鉴于CpG基团对先天性免疫系统的激活作用，有人提出利用含有CpG基团的寡核苷酸链（Oligodeoxynucleotide，ODN）作为佐剂使用。

        近几年来，CpG ODN是在疫苗研究过程中被应用最广泛的佐剂成分之一。大量的研究发现，CpG ODN对免疫细胞的激活作用主要决定于其序列组成。根据功能不同一般将CpG ODN分为 A、B和C三种类型[7]。A型CpG ODN（最初被称作D型）序列中含有一个CpG基团，但在其3’末端含有多个G（Poly G）的重复序列。A型CpG ODN主要对NK淋巴细胞具有激活作用，能够刺激NK细胞合成和分泌TNF－γ因子。因而，A型CpG ODN的主要作用是激活细胞免疫应答反应。B型CpG ODN的序列内一般含有多个CpG基团，在序列的末端没有任何重复核苷酸序列。这种CpG ODN主要作用于B淋巴细胞，激活体液免疫应答反应。C型CpG ODN至少含有两个CpG基团，此外在序列的5’端还含有一个或两个TCG序列。C型CpG ODN对B淋巴细胞和NK细胞都有激活作用。由于高等动物之间遗传背景上的差异，一个CpG ODN在不同动物体内的作用可能存在很大的差异，如在小鼠体内具有很强免疫激活作用的CpG ODN在灵掌类动物体内的作用就可能很有限。因而在设计或选择CpG ODN佐剂过程还应该考虑最终被免疫的个体遗传背景。目前处于临床实验阶段的CpG ODN佐剂种类很多，但还没有一种商品化的CpG ODN佐剂。

        结束语
        以上介绍的几种佐剂是目前免疫和疫苗研究过程中应用比较广泛的佐剂。随着越来越多的生物基因组序列的破译，将会使很多新发现的抗原成分被纳入疫苗研究过程中。然而提高亚单位抗原成分的免疫原性往往有赖于有效的佐剂。对佐剂的研究一直是疫苗研究过程中的重要环节。理想的佐剂应该是广谱、无副作用、对免疫系统具备有效的激活作用，同时便于生产和使用。目前还没有任何一种佐剂具备这些要求。随着人们对各种病原体的抗原成分的不断深入的了解和抗感染（抗病）免疫机理的认识，对佐剂的研究也会更具目标性。
Tags - 佐剂 ]]> http://bio.ccxxba.com/read.php/17.htm 飞翔的猪 <> Tue, 01 Apr 2008 13:03:17 +0000 http://bio.ccxxba.com/read.php/17.htm
        在疫苗产品中兽用疫苗占整个疫苗市场的20%，兽用疫苗在疫苗市场中是前、点、元的的概念。在全球中疫苗的主要市场是北美和西欧，占到50%左右，主要是因为这些国家的畜牧业发达，且美国、日本控制着疫苗的价格，在1998年以后疫苗产品的种类以80%的速度在增长，其中以亚洲占据领先水平。

        疫苗市场的特点：1.条块性：与动物品种息息相关；2.经济特性：受畜牧业经济状况的影响，市场的变化，科学技术的进步都会使疫苗市场受到影响。3.法规特性：受法律、法规的变化影响非常大。

        市场变化的方向：1.使用更安全、更有效的基因工程疫苗2.发现新的免疫途径3.调节免疫期，传播母源抗体4.创造特殊的免疫接种工具。

        对中国疫苗的思考

        1.简化、改进、加速新产品的审批。

        建立专职审批制度，一站式。建立快速审批制度（如口蹄疫疫苗疫苗和禽流感）。建立自家疫苗审批制度。质量标准有效性的评价观念的转变 ，从免疫攻毒保护试验向提高生产性能评价的转变。生产性能评价可为三个层次：产品可预防的病的种类；产品有助于预防病的种类；能够提高某个动物的生产性能。

        2.提高新产品开发力度:加大对疫苗新产品投入资金。

        3.关键技术的创新和应用。
        （1）原材料改进技术，病毒产品使用传代细胞，基因工程细菌，细菌产品方向是合成培养基。
        （2）培养技术，病毒产品使用微载体反应器，细菌产品使用发酵系统。
        （3）纯化技术
        （4）浓缩技术在国内用的比较少，是一个努力的方向。
        （5）降低动物实验，将动物实验降到最低度，尽量不用动物作实验；精化和提高。

        4.疫苗的品种创新
        （1）各类联苗的创新，特别是猪的联苗（猪瘟、猪丹毒、猪肺疫），此外，还有病毒与细菌的联苗及灭活疫苗与活疫苗的组配。
        （2）细菌类疫苗的创新。
        （3）人畜共患传染病疫苗
        （4）灭活疫苗发展的方向是高效免疫佐剂  
Tags - 疫苗 ]]> http://bio.ccxxba.com/read.php/16.htm 飞翔的猪 <> Tue, 01 Apr 2008 12:58:23 +0000 http://bio.ccxxba.com/read.php/16.htm
        靶向克隆法是一种新的基因克隆方法，该克隆方法的特点是：在基因克隆过程中不使用已有的DNA Ligase，而是使用新开发的靶向克隆酶。靶向克隆酶能够使末端序列相同的双链DNA(14bp-18bp)同源重组，从而达到克隆基因的目的。

        LP Recco酶，中文名：靶向克隆酶，无需传统基因克隆所需要的限制性内切酶和连接酶，使基因克隆位点选择的限制性大大减少；能在一天之内完成从PCR开始到转化的全部过程；阳性克隆不存在方向相反的问题，百分之百的正向连接；如果实验顺利，2－3天即可得到研究人员所需要的克隆。而传统的克隆方法由于需要寻找与需要克隆的基因和载体相适应的限制性内切酶位点、连接酶连接以及挑选方向正确的阳性克隆，整个过程需要两个星期到三个月不等，有时由于找不到合适的限制性内切酶位点，甚至根本无法克隆研究人员感兴趣的基因。LP Recco酶将为基因克隆技术带来一场革命性的变革。

        ◆ LP Recco酶特点：
        准确、定向克隆PCR扩增的基因片断
        无需限制性内切酶
        不用去磷酸化载体，无需连接酶
        适用任何类型的克隆载体、插入片断和酶切位点
        只要线性化载体就行（单酶切、双酶切均可），不用酶切PCR产物，不用补平末端
        可使用任何类型的Taq酶（常规Taq、各种高保真酶均可）的扩增产物
        操作简单，将混合物25℃孵育30min即可转化
        可克隆长达12Kb的基因片断
        克隆效率高，转化率高
        重复性高、可靠性好——可用于高通量操作，批量克隆 ]]>